jenabioscience:Atto425 NT Labeling Kit  貨號(hào)：PP-305L-425

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學(xué)家于1998年成立，利用超過(guò)25年的學(xué)術(shù)知識(shí)為100多個(gè)國(guó)家的研究和行業(yè)客戶開(kāi)發(fā)創(chuàng)新試劑。

供一般實(shí)驗(yàn)室使用。

運(yùn)輸:凝膠包裝運(yùn)輸

儲(chǔ)存條件:儲(chǔ)存在-20°C
避免冷凍/解凍循環(huán)，避光儲(chǔ)存

保質(zhì)期:12個(gè)月

光譜特性: λexc436納米，λ全身長(zhǎng)的484納米，ε 45.0毫摩爾-1厘米-1(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH 7.5)

描述:
Atto425缺口翻譯標(biāo)記試劑盒包含缺口翻譯標(biāo)記所需的所有試劑(除了用于純化探針的模板和材料),提供了一種高效、易于實(shí)施和快速的標(biāo)記技術(shù)。
該試劑盒被推薦用于DNA的直接酶標(biāo)記。Atto425 NT標(biāo)記混合物包含經(jīng)過(guò)特別優(yōu)化的Atto425-dUTP，可通過(guò)DNA聚合酶I進(jìn)行缺口翻譯，從而整合到DNA中。熒光團(tuán)出色的穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率，加上染料-dUTP復(fù)合物的高整合率，使其成為各種熒光應(yīng)用的理想選擇。
缺口翻譯標(biāo)記基于聚合酶I和脫氧核糖核酸酶I的反向活性。脫氧核糖核酸酶I能夠在低酶濃度下將隨機(jī)分布的缺口引入雙鏈DNA。聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性從缺口的3’側(cè)去除核苷酸，同時(shí)使用3’-OH末端作為引物合成部分新的互補(bǔ)鏈。在存在染料標(biāo)記的dUTP聚合酶的情況下，I摻入標(biāo)記的dUTP而不是dTTP。酶混合物中平衡良好的聚合酶/核酸酶活性確保了高度標(biāo)記的雙鏈DNA片段的產(chǎn)生。
所得DNA適用于FISH、微陣列基因表達(dá)譜和其他核酸雜交分析。
保護(hù)熒光標(biāo)記的dUTP免受光照射，并在弱光條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序。

內(nèi)容:
酶混合物(紅色瓶蓋)
儲(chǔ)存緩沖液中的2單位/微升聚合酶I和0.02單位/微升脫氧核糖核酸酶I

NT標(biāo)記緩沖液(綠色瓶蓋)
10倍濃度

Atto425 NT標(biāo)簽混合物(紫色瓶蓋)
0.5毫米dATP、0.5毫米dCTP、0.5毫米dGTP、0.25毫米dTTP、
0.25毫米Atto425-dUTP，pH 7.5

停止緩沖器(黃色蓋子)
0.5 M EDTA，pH 8.0

PCR級(jí)水(白色瓶蓋)

推薦的NT檢測(cè):
樣品材料可以是超螺旋或線性化的質(zhì)粒DNA、粘?；駼AC DNA、完整或部分染色體或純化的PCR產(chǎn)物。
在無(wú)菌小瓶中制備以下反應(yīng)混合物。
20 μl缺口翻譯標(biāo)記分析

• 輕輕渦旋混合物以確保均勻，并短暫離心以收集試管底部的反應(yīng)混合物。
• 將試管置于15°c預(yù)冷的熱混合器中。建議孵育90分鐘，以產(chǎn)生大小在200和500 bp之間的DNA片段。
• 為了控制片段的長(zhǎng)度，在瓊脂糖凝膠上加載2 μl分析物。運(yùn)行凝膠時(shí)，將反應(yīng)管置于-20°C。
• 為了獲得更小的片段，添加額外的2 μl酶混合物，并在15℃下延長(zhǎng)孵育時(shí)間
• 為最終終止反應(yīng)，添加5 μl終止緩沖液(黃色瓶蓋)。進(jìn)行純化或儲(chǔ)存在-20°c下

探針的純化:
為了在反應(yīng)混合物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)之前從反應(yīng)混合物中除去未摻入的核苷酸，建議采用以下程序之一:
1.硅膠膜吸附純化- PCR純化試劑盒。不，第201頁(yè)
Jena Bioscience PCR純化試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單有效的方法來(lái)純化大于100 bp的DNA片段。該制劑基于二氧化硅膜技術(shù)，用于在高鹽中結(jié)合DNA，并在低鹽緩沖液中洗脫。請(qǐng)參考說(shuō)明書(shū)。
2.異丙醇沉淀提純
向反應(yīng)混合物中加入1 μl糖原(2 mg/ml)、2 μl乙酸鈉(3 M)和14 μl異丙醇，并輕輕充分混合。室溫下孵育15分鐘，并在4℃下以最大速度旋轉(zhuǎn)30分鐘。棄去上清液，用70 %乙醇洗滌2次(以最大速度旋轉(zhuǎn)5分鐘)。
3.離心過(guò)濾裝置凈化
未摻入的核苷酸可以用離心過(guò)濾裝置通過(guò)離心去除。根據(jù)DNA片段的截止值選擇過(guò)濾器裝置，并遵循制造商的說(shuō)明。

熒光團(tuán)的摻入率:
DNA標(biāo)記的效率可以通過(guò)計(jì)算摻入的熒光團(tuán)與片段中堿基數(shù)量的比率(染料/堿基)來(lái)估計(jì)。
1.光密度的測(cè)量:測(cè)量標(biāo)記的DNA片段在260 nm處的吸光度(A260)和激發(fā)最大值(λexc)為染料(A給…染色).
2.A的校正260閱讀:為了獲得核酸的精確吸光度測(cè)量，必須校正260 nm處染料的貢獻(xiàn)。使用以下等式:
A基礎(chǔ)= A260-(答給…染色x CF260)
Atto425的校正系數(shù):CF260 = 0.27
3.標(biāo)記率的計(jì)算:染料與堿的比例由下式給出:
染料/堿= (A給…染色x ε基礎(chǔ))/ (A基礎(chǔ)x ε給…染色)
消光系數(shù):
Atto425: ε給…染色= 45000厘米-1 M-1
dsDNA: ε基礎(chǔ)= 6600厘米-1 M-1
ssDNA: ε基礎(chǔ)= 8900厘米-1 M-1
寡核苷酸:ε堿基= 10000cm-1 M-1
實(shí)施例:染料與堿基之比為0.05對(duì)應(yīng)于將10個(gè)dye-dUTP核苷酸分別摻入到含有200個(gè)核苷酸的DNA片段中，或者摻入到100 bp的PCR片段中。如果可以假設(shè)dATP、dCTP、dGTP和dTTP在DNA片段中的平均分布，50個(gè)現(xiàn)有dttp中的10個(gè)已經(jīng)被dye-dUTP取代，導(dǎo)致20 %的標(biāo)記率。

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