吸光度測(cè)量基礎(chǔ)知識(shí)

紫外-可見光吸光度測(cè)量長(zhǎng)期以來(lái)一直是生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室中定量純化生物分子的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法允許根據(jù)分子在特定波長(zhǎng)下的吸光度曲線快速檢測(cè)分子。

吸光度還提供樣品污染的指示。吸光度光譜的形狀將根據(jù)其他分子的存在而變化，這些分子的吸收波長(zhǎng)與目標(biāo)分子相同或接近相同波長(zhǎng)。

熒光定量基礎(chǔ)知識(shí)

熒光團(tuán)是吸收一個(gè)波長(zhǎng)（激發(fā)波長(zhǎng)）的光并發(fā)射另一個(gè)波長(zhǎng)（發(fā)射波長(zhǎng)）的光的分子。某些熒光團(tuán)的結(jié)構(gòu)只有在與特定分子（例如雙鏈 DNA）結(jié)合時(shí)才能發(fā)出熒光。熒光檢測(cè)利用這種結(jié)合特異性來(lái)建立樣品發(fā)射的熒光量與溶液中目標(biāo)生物分子濃度之間的直接關(guān)聯(lián)。

通過(guò)將熒光基團(tuán)與已知濃度的樣品混合并測(cè)量相對(duì)熒光單位 （RFU），可以繪制濃度與測(cè)得的 RFU 之間的關(guān)系，并將其用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后可以將與未知樣品結(jié)合的相同熒光團(tuán)的發(fā)射光與該標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖，以確定樣品濃度。

比較吸光度和熒光結(jié)果

在比較基于吸光度的方法和基于熒光的方法的結(jié)果時(shí)，重要的是要考慮每種方法的特異性。例如，在 260 nm 處的吸光度測(cè)量對(duì) dsDNA 沒有選擇性，因?yàn)?ssDNA 和 RNA 也在 260 nm 處吸收。在 260 nm 處的任何吸光度測(cè)量都是對(duì)樣品中所有核酸和存在的任何污染物（包括蛋白質(zhì)）的測(cè)量。這適用于所有類型的測(cè)量，而不僅僅是核酸。因此，吸光度法非常適合測(cè)量純樣品。

相比之下，熒光檢測(cè)對(duì)給定的分析物具有高度特異性，包括但不限于 dsDNA、ssDNA、RNA 或蛋白質(zhì)。通常，通過(guò)吸光度測(cè)量的樣品濃度大于通過(guò)熒光方法測(cè)量的濃度。