化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）誕生于1977年，根據(jù)放射免疫分析的基本原理，將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析法。 CLIA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)單、不需要非常昂貴的設(shè)備等特點(diǎn)。

化學(xué)發(fā)光免疫分析是高靈敏度化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)與高特異性免疫反應(yīng)的結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物的檢測(cè)和分析。 。它是繼放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的最新免疫分析技術(shù)。

CLIA的應(yīng)用范圍很廣，不僅可以檢測(cè)不同分子大小的抗原、半抗原和抗體，還可以用于核酸探針的檢測(cè)。與放射免疫分析（RIA）、熒光免疫分析（IFA）和酶免疫分析（EIA）相比，CLIA具有無輻射、標(biāo)記物有效期長(zhǎng)、全自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。 CLIA 為獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)和食品分析測(cè)試和科學(xué)研究提供痕量或超痕量非同位素免疫分析。

一、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的基本原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析包含免疫分析和化學(xué)發(fā)光分析兩個(gè)系統(tǒng)。免疫分析系統(tǒng)采用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或酶作為標(biāo)記物，直接標(biāo)記在抗原或抗體上，通過抗原與抗體反應(yīng)形成抗原抗體免疫復(fù)合物。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是在免疫反應(yīng)后添加氧化劑或酶的發(fā)光底物。化學(xué)發(fā)光物質(zhì)被氧化劑氧化后，形成處于激發(fā)態(tài)的中間體，該中間體發(fā)射光子釋放能量回到穩(wěn)定的基態(tài)。發(fā)光強(qiáng)度可以使用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x來檢測(cè)。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系，可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分析物的含量。

2. 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型

化學(xué)發(fā)光免疫分析根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為三類，即化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。

2.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定是一類用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的免疫測(cè)定。目前常見的標(biāo)記物主要是魯米諾和吖啶酯化學(xué)發(fā)光劑。

2.1.1 魯米諾標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析

魯米諾物質(zhì)的發(fā)光是氧化反應(yīng)發(fā)光。在堿性溶液中，魯米諾可被多種氧化劑氧化，其中常用的是H2o2。由于發(fā)光反應(yīng)速度慢，需要添加一些酶或無機(jī)催化劑。酶主要是辣根過氧化物酶（HRP），無機(jī)類有O3、鹵素和Fe3、Cu2、Co2及其復(fù)合物。

早期主要用于無機(jī)和有機(jī)生物小分子的測(cè)定，因標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度下降而導(dǎo)致靈敏度降低。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)光體系中添加一些酚類及其衍生物、胺類及其衍生物、苯基硼酸衍生物，可以顯著增強(qiáng)體系的發(fā)光能力，發(fā)光強(qiáng)度可提高1000倍，“背景"發(fā)光明顯降低，發(fā)光時(shí)間也延長(zhǎng)。這些增強(qiáng)劑的使用使得化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法能夠廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸分析領(lǐng)域。

2.1.2吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析：吖啶酯由于熱穩(wěn)定性差而用于CLIA，通過研究合成了更穩(wěn)定的吖啶酯衍生物。在H2o2和OH的條件下，吖啶酯類化合物可以快速發(fā)光，并且量子產(chǎn)率很高。例如吖啶芳基酯的量子產(chǎn)率可以達(dá)到0.05。采用吖啶酯作為免疫分析的標(biāo)記物，發(fā)光系統(tǒng)簡(jiǎn)單。 、速度快、無需添加催化劑、標(biāo)記效率高、背景低。這些特點(diǎn)引起了廣大分析診斷工作者的極大興趣。

2.2 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（cLEIA）是酶免疫分析的一種，只不過酶促反應(yīng)的底物是發(fā)光劑。然后酶作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑的作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)分析儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)量。

常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP），它們都有各自的發(fā)光底物。

常用的 HRP 發(fā)光底物是魯米諾及其衍生物。在CLEIA中，使用過氧化物酶標(biāo)記的抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)后，以魯米諾作為發(fā)光底物，魯米諾在過氧化物酶和起始發(fā)光試劑（NaOH和H2o2）的作用下發(fā)光，酶免疫反應(yīng)中酶的濃度該物質(zhì)決定化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度。這種傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光體系（HRP-H2O2-LUMINOL）在幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光，存在發(fā)光強(qiáng)度低、測(cè)量困難的缺點(diǎn)。后來在發(fā)光系統(tǒng)中添加了增強(qiáng)型發(fā)光劑，增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)并保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定，以利于重復(fù)測(cè)量，從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。

堿性磷酸酶（ALP）已廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫分析和核酸雜交分析。堿性磷酸酶和1,2。由二氧雜環(huán)丁烷組成的發(fā)光體系是目前化學(xué)發(fā)光體系中最重要、靈敏的一類。此類系統(tǒng)的代表是ALP-AMPPD發(fā)光系統(tǒng)。 AMPPD在溶液中的磷酸鍵非常穩(wěn)定，非酶水解非常緩慢。在pH12的0.05mol/L碳酸鈉緩沖溶液中，分解半衰期可達(dá)74年，且?guī)缀醪淮嬖谠噭┍旧淼陌l(fā)光背景。 AMPPD是磷酸酶的直接發(fā)光底物，可用于檢測(cè)堿性磷酸酶或抗體、核酸探針和其他配體的綴合物。 ALP-AMPPD發(fā)光系統(tǒng)具有非常高的靈敏度，標(biāo)記物ALP的檢出限達(dá)到10-21mol，是靈敏的免疫分析方法之一。對(duì)AMPPD進(jìn)行改進(jìn)，得到反應(yīng)動(dòng)力學(xué)更好、靈敏度更高的新一代產(chǎn)品：CSPD、CDP-Star。這些系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種基因和病原體DNA的鑒定。

2.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析

電化學(xué)發(fā)光（ECL）是指由電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光過程。 ECL反應(yīng)在電極表面進(jìn)行，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)2+3]，三丙胺(TPA)用于激發(fā)光反應(yīng)。在陽(yáng)極表面，兩種物質(zhì)同時(shí)失去電子。在電極板上，Ru(byp)2+3 被氧化為 Ru(byp)3+3，TPA 也被氧化為陽(yáng)離子自由基（TPA+#），TPA+# 自發(fā)釋放質(zhì)子，成為不穩(wěn)定分子（TPA * ） ，將電子傳遞給 Ru(byp)3+3，形成激發(fā)態(tài) Ru(byp)2+3。 Ru(byp)3+3在衰變時(shí)發(fā)射出波長(zhǎng)為620NM的光子，并返回到基態(tài)Ru(byp)2+3。這個(gè)過程在電極表面重復(fù)進(jìn)行，產(chǎn)生高效穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光，并不斷增強(qiáng)。

ECL的突出優(yōu)點(diǎn)是：

①標(biāo)記物分子小，可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記，且標(biāo)記物非常穩(wěn)定；

②發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度高；

③光信號(hào)線性好，動(dòng)態(tài)范圍寬，超過6個(gè)數(shù)量級(jí)；

④ 可重復(fù)測(cè)量，重現(xiàn)性好；

⑤ 可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)和均相免疫分析；

⑥速度快，通常只需18分鐘即可完成一個(gè)樣品的分析；

⑦全自動(dòng)化。電化學(xué)發(fā)光免疫分析由于其*性，是一種很有前景的免疫分析方法，越來越受到人們的重視。它已廣泛應(yīng)用于抗原、半抗原和抗體的免疫檢測(cè)。

3. 申請(qǐng)

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）和發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是化學(xué)發(fā)光免疫分析中常用的兩種免疫分析方法。底物是發(fā)光劑的基礎(chǔ)。根據(jù)儀器的檢測(cè)自動(dòng)化程度，儀器可分為自動(dòng)和半自動(dòng)兩種。目前國(guó)內(nèi)臨床市場(chǎng)的全自動(dòng)產(chǎn)品大部分都是進(jìn)口產(chǎn)品；根據(jù)分離技術(shù)，儀器分為磁珠分離和塑料孔板分離兩種。

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中有很多應(yīng)用，包括腫瘤標(biāo)志物、心臟標(biāo)志物、甲狀腺功能、胰島素和C肽以及糖尿病、傳染病、骨代謝、細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)激素系統(tǒng)、貧血診斷和鑒別診斷、過敏反應(yīng)等和監(jiān)測(cè)治療藥物濃度。