熒光顯微鏡：熒光顯微鏡是利用紫外光作為光源照射被檢物體，使其發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀和位置。

熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、分布和定位。細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)，如葉綠素，受紫外線照射后能發(fā)出熒光；有些物質(zhì)本身不能發(fā)出熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色，在紫外線照射下也能發(fā)出熒光。對(duì)此類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。

確認(rèn)

熒光顯微鏡與普通顯微鏡有以下區(qū)別：
1、照明方式通常為落射照明，即光源通過(guò)物鏡投射到樣品上；
2、有兩片特殊濾光片，光源前面的一片用于濾除可見(jiàn)光，目鏡與物鏡之間的一片用于濾除紫外線，保護(hù)人眼。
熒光顯微鏡也是光學(xué)顯微鏡的一種，主要區(qū)別在于兩者的激發(fā)波長(zhǎng)不同。這就決定了熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡在結(jié)構(gòu)和用途上的差異。
熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的重要工具。它由光源、濾光板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。它是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大觀察標(biāo)本的熒光圖像。

工作準(zhǔn)則

光源
多采用200W超高壓汞燈作為光源。它由石英玻璃制成，中間呈球形，里面充有一定量的水銀。工作時(shí)，兩個(gè)電極之間放電使汞蒸發(fā)，球內(nèi)壓力迅速升高。當(dāng)汞全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)到50至70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，這個(gè)過(guò)程一般需要5至15分鐘左右。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使汞分子不斷解離還原時(shí)發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)出強(qiáng)烈的紫外線和藍(lán)紫色光，足以激發(fā)各種熒光物質(zhì)，因此常用于熒光顯微鏡。
超高壓汞燈也會(huì)釋放大量的熱能。因此，燈室必須具有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜過(guò)高。
新型超高壓汞燈在使用初期無(wú)需高壓即可點(diǎn)燃。使用一段時(shí)間后，需要用高壓（15000V左右）啟動(dòng)。啟動(dòng)后，維持工作電壓一般為50-60V，工作電流為4A左右。 200W超高壓汞燈每次使用2小時(shí)，平均壽命約為200小時(shí)。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過(guò)程中，其光效逐漸降低。燈熄滅后，等待其冷卻后再重新啟動(dòng)。點(diǎn)亮后不要立即關(guān)閉燈泡，以免汞蒸發(fā)不全而損壞電極，一般需要等待15min。由于超高壓汞燈壓力高，紫外線強(qiáng)，燈泡必須放入燈室內(nèi)才能點(diǎn)燃，以免傷眼和爆炸。
超高壓汞燈（100W或200W）的光源電路包括變壓、鎮(zhèn)流器、啟動(dòng)等幾部分。燈箱上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡燈泡后面安裝有鍍鋁凹面反射鏡，前面安裝有聚光透鏡。

濾色鏡系統(tǒng)
濾色鏡系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要組成部分，由激發(fā)濾光板和壓濾光板組成。濾板的型號(hào)、各廠家的名稱(chēng)往往不統(tǒng)一。濾光板一般以基本色調(diào)來(lái)命名，前面的字母代表色調(diào)，后面的字母代表玻璃，數(shù)字代表型號(hào)特征。例如德國(guó)產(chǎn)品（肖特）BG12是一種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的第一個(gè)字母，G是玻璃的第一個(gè)字母；有一些廠家的濾板全用數(shù)字命名，如美國(guó)康寧廠的濾板。 NO：5-58，相當(dāng)于BG12。

1.激發(fā)濾光板根據(jù)光源和熒光顏料的特性，可以選擇以下三種類(lèi)型的激發(fā)濾光板，以提供一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾光片：該濾光片可透過(guò)400nm以下的紫外光，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。常用的型號(hào)有UG-1或UG-5，再加一個(gè)BG-38來(lái)消除紅色尾流。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾光板：該濾光板可以通過(guò)300-450nm范圍內(nèi)的光。常用型號(hào)有ZB-2或ZB-3，加上BG-38。
紫藍(lán)色激發(fā)濾光片：可通過(guò)350～490nm的光。常用型號(hào)為QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上的熒光素（如羅丹明色素）可以被藍(lán)綠色濾光板（如B-7）激發(fā)。
使用金屬膜干涉濾光片。由于其針對(duì)性強(qiáng)、波長(zhǎng)合適，激發(fā)效果比玻璃濾光片更好。例如西德Leitz工廠的FITC專(zhuān)用KP490濾板和羅丹明的S546綠色濾板都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于玻璃濾板。
激勵(lì)濾光片分為薄型和厚型兩種。一般暗視野使用較薄的濾光板，明視場(chǎng)熒光顯微鏡可使用較厚的濾光板。基本要求是獲得最亮的熒光和好的背景。

2、壓制濾光板 壓制濾光板的作用是全阻擋激發(fā)光的通過(guò)，并提供相應(yīng)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光。與激發(fā)濾光板相對(duì)應(yīng)，常用的有以下三種壓制濾光板：
紫外光壓制濾光板：可透過(guò)可見(jiàn)光，阻擋紫外線透過(guò)?？膳c UG-1 或 UG-5 結(jié)合使用。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍(lán)壓濾板：可通過(guò)波長(zhǎng)510nm以上（綠至紅）的光，可與BG-12組合使用。通常使用OG-4K510或OG-1K530。
紫外壓制濾光板：可透過(guò)波長(zhǎng)460nm以上（藍(lán)到紅）的光，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490、K510。

反光罩
反光罩的反射層一般采用鍍鋁，因?yàn)殇X在紫外光和可見(jiàn)光的藍(lán)紫光區(qū)吸收較少，反射率在90%以上，而銀的反射率只有70%；一般采用平面反射器。

專(zhuān)
為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)的聚光鏡由石英玻璃或其他傳輸紫外線的玻璃制成。有光場(chǎng)聚光鏡和暗場(chǎng)聚光鏡兩種。還有相襯熒光聚光器。
1. 明場(chǎng)聚光鏡 明場(chǎng)聚光鏡常用于一般熒光顯微鏡。聚光能力強(qiáng)，使用方便。特別適合低倍和中倍放大標(biāo)本的觀察。
2. 暗視野聚光鏡 暗視野聚光鏡越來(lái)越多地用于熒光顯微鏡。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，除了散射光外，激發(fā)光不進(jìn)入目鏡?？梢允褂帽〉募ぐl(fā)濾光片來(lái)增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度，并且壓濾光片也可以很薄。無(wú)色濾光片（無(wú)紫外線透射），同時(shí)仍產(chǎn)生深色背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和對(duì)比度，提高了圖像質(zhì)量，觀察舒適，并且可以發(fā)現(xiàn)明場(chǎng)中難以區(qū)分的細(xì)小熒光顆粒。
3、相襯熒光聚光鏡 相襯聚光鏡與相襯物鏡配合使用，可以同時(shí)進(jìn)行相襯和熒光相結(jié)合的觀察，既可以看到熒光圖像，又可以看到相襯圖像。有助于熒光的準(zhǔn)確定位。一般熒光觀察很少需要這種聚光鏡。

物鏡
可以使用多種物鏡，但優(yōu)選消色差物鏡，因?yàn)樗淖园l(fā)熒光最小，并且其透射率（波長(zhǎng)范圍）適合熒光。由于顯微鏡視場(chǎng)內(nèi)圖像的熒光亮度與物鏡孔徑比的平方成正比，與其放大倍數(shù)成反比，因此為了提高熒光圖像的亮度，需要采用大孔徑的物鏡。應(yīng)使用孔徑比。尤其是在高倍放大下，其效果非常明顯。因此，對(duì)于熒光不足的標(biāo)本，應(yīng)使用大孔徑比的物鏡，目鏡盡可能低（4×、5×、6.3×等）。

目鏡
在熒光顯微鏡中使用低倍目鏡，例如 5× 和 6.3×。過(guò)去經(jīng)常使用單目目鏡，因?yàn)槠淞炼仁请p目目鏡的兩倍以上，但研究型熒光顯微鏡大多使用雙目目鏡，觀察非常方便。
落射光裝置
新型落射光器件是光源發(fā)出的光照射到干涉分光濾光片后，由于濾光片上涂層的性質(zhì)，短波長(zhǎng)部分（紫外線和紫藍(lán)色）被反射。當(dāng)濾光片面向光源時(shí)，為45度。傾斜時(shí)垂直射向物鏡，然后通過(guò)物鏡射向標(biāo)本，使標(biāo)本受到激發(fā)，物鏡直接起聚光作用。同時(shí)，濾光片的長(zhǎng)部分（綠色、黃色、紅色等）對(duì)于濾光片來(lái)說(shuō)是透明的。因此，它不會(huì)反射向物鏡，并且濾光片充當(dāng)激發(fā)濾光片。由于標(biāo)本的熒光處于可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)，可以通過(guò)濾光片到達(dá)目鏡進(jìn)行觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)的增加而增加，并且在高放大倍數(shù)下比透射光源更強(qiáng)。除具有透射光源的功能外，更適合直接觀察不透明和半透明標(biāo)本，如厚片、濾光片、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱(chēng)為落射熒光顯微鏡。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱(chēng)為落射熒光顯微鏡。研制的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱(chēng)為落射熒光顯微鏡。

CCD

簡(jiǎn)介
熒光顯微鏡CCD是與熒光顯微鏡密切相關(guān)的數(shù)碼相機(jī)產(chǎn)品。一方面可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產(chǎn)物通過(guò)USB接口傳輸至計(jì)算機(jī)，方便圖像采集和研究。另一方面，通過(guò)熒光顯微鏡CCD我們可以比單獨(dú)使用熒光顯微鏡拍攝更好的照片。熒光顯微鏡CCD可與熒光顯微鏡連接構(gòu)成顯微成像系統(tǒng)。

使用范圍
一般情況下，單獨(dú)使用熒光顯微鏡就可以達(dá)到理想的成像效果，但在某些情況下，比如當(dāng)熒光比較弱時(shí)，單獨(dú)使用熒光顯微鏡無(wú)法達(dá)到理想的拍攝效果，或者我們希望您可以上傳拍攝的照片熒光圖像傳輸至計(jì)算機(jī)，用于預(yù)覽、修改甚至發(fā)表學(xué)術(shù)論文。這時(shí)如果沒(méi)有熒光顯微鏡CCD就無(wú)法滿足要求。

特點(diǎn)
熒光顯微鏡CCD一般具有良好的弱光捕獲能力，可以捕獲極弱的熒光，因此成像能力良好。另外，不少熒光冷CCD生產(chǎn)公司都對(duì)CCD進(jìn)行了這樣的制冷處理，使得該類(lèi)CCD的噪聲大大增加。減少，信噪比可以大大提高。由于其方便的應(yīng)用效果，此類(lèi)CCD相機(jī)廣泛應(yīng)用于熒光顯微鏡中。

標(biāo)本制備要求

熒光顯微鏡的標(biāo)本制備要求
1. 載玻片
載玻片的厚度應(yīng)在 0.8 至 1.2 毫米之間。一方面，如果坡度太厚，會(huì)吸收更多的光，另一方面，激發(fā)光不能集中在標(biāo)本上。載玻片必須光滑、厚度均勻且無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)使用石英玻璃載玻片。

2、蓋玻片
蓋玻片厚度約為0.17mm，光滑、潔凈。為了加強(qiáng)激發(fā)光，還可以使用干涉蓋玻片，它是一種特殊的蓋玻片，上面鍍有幾層物質(zhì)（如氟化鎂），這些物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光有不同的干涉效果。平滑地通過(guò)，同時(shí)反射激發(fā)光，該反射的激發(fā)光可以激發(fā)樣本。

3、標(biāo)本
組織切片或其他標(biāo)本不宜太厚，太厚則大部分激發(fā)光消耗在標(biāo)本下部，物鏡直接觀察的上部激發(fā)不夠充分。另外，細(xì)胞的重疊或雜質(zhì)的掩蔽也會(huì)影響判斷。

4.封固劑
甘油是常用的封固劑。它必須是無(wú)色透明且無(wú)自發(fā)熒光的。 pH值8.5~9.5時(shí)熒光亮度較亮，且不易快速消失。

5、鏡油
一般用暗場(chǎng)熒光顯微鏡和油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油。最好使用專(zhuān)用的非熒光鏡片油。也可以使用上述的甘油來(lái)代替。也可以使用液體石蠟，但折射率較低，圖像質(zhì)量略有影響。影響。

指示

(1)打開(kāi)光源，超高壓汞燈需要預(yù)熱15分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。
(2)對(duì)于透射型熒光顯微鏡，應(yīng)在光源和暗場(chǎng)聚光鏡之間安裝所需的激發(fā)濾光片，并在物鏡后面安裝相應(yīng)的壓濾光片。對(duì)于落射熒光顯微鏡，需要將所需的激發(fā)濾光片、二色分束器和壓濾光片插入件插入光路中的槽中。
(3)用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置調(diào)節(jié)光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中心。
(4) 放置標(biāo)本片，調(diào)焦后觀察。使用時(shí)應(yīng)注意：未安裝濾光片時(shí)請(qǐng)勿用眼睛直接觀察，以免造成眼睛損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用無(wú)熒光的專(zhuān)用鏡油；高壓汞燈關(guān)閉后，不能立即再次打開(kāi)，需要等待。水銀燈必須全冷卻后才能重新啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響水銀燈的壽命。
(5)觀察。例如，在熒光顯微鏡下使用藍(lán)紫色濾光片，觀察用0.01%吖啶橙熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光（深綠色和橙紅色）。

防范措施

(1)嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作，不得隨意改變程序。
(2)檢查應(yīng)在暗室中進(jìn)行。進(jìn)入暗室后，接通電源，點(diǎn)亮超高壓汞燈5-15分鐘。光源發(fā)出的強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛全適應(yīng)暗室，然后開(kāi)始觀察標(biāo)本。
(3)為防止紫外線對(duì)眼睛的傷害，調(diào)節(jié)光源時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡。
(4)檢查時(shí)間每次以1～2小時(shí)為宜。如果超過(guò)90分鐘，超高壓汞燈的發(fā)光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降，熒光也會(huì)減弱；標(biāo)本經(jīng)紫外線照射3～5分鐘后，熒光也會(huì)明顯減弱；因此，不應(yīng)超過(guò)2至3小時(shí)。
(5)熒光顯微鏡光源的壽命有限，應(yīng)集中檢查標(biāo)本，以節(jié)省時(shí)間并保護(hù)光源。天氣炎熱時(shí)，應(yīng)加風(fēng)扇降溫，并從更換新燈泡時(shí)開(kāi)始記錄使用時(shí)間。燈泡熄滅后想再次使用時(shí)，必須等燈泡冷卻后再點(diǎn)亮。應(yīng)避免每天多次點(diǎn)亮光源。
(6) 染色后立即觀察標(biāo)本，隨著時(shí)間的推移熒光會(huì)逐漸減弱。如果將標(biāo)本保存在4℃的聚乙烯塑料袋中，可以延遲熒光減弱時(shí)間，并可以防止封片劑蒸發(fā)。激發(fā)光長(zhǎng)期照射標(biāo)本會(huì)引起熒光衰減和消失，因此應(yīng)盡量縮短照射時(shí)間。暫時(shí)不觀察時(shí)可用遮光罩遮擋激發(fā)光。
(7)觀察標(biāo)本時(shí)應(yīng)使用非熒光油，并避免眼睛直視紫外光源。
(8)電源應(yīng)配備穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)定會(huì)降低日光燈的壽命。

熒光顯微鏡與普通顯微鏡有以下區(qū)別：
1、照明方式通常為落射照明，即光源通過(guò)物鏡投射到樣品上；
2、光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨率比普通顯微鏡高；
3、有兩片特殊濾光片，光源前面的一片用于濾除可見(jiàn)光，目鏡與物鏡之間的一片用于濾除紫外線，保護(hù)人眼。
熒光顯微鏡也是光學(xué)顯微鏡的一種，主要區(qū)別在于兩者的激發(fā)波長(zhǎng)不同。這就決定了熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡在結(jié)構(gòu)和用途上的差異。
熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的重要工具。它由光源、濾光板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。它是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大觀察標(biāo)本的熒光圖像。